在微生物发酵过程中，灭菌是至关重要的一环，直接影响发酵的成功率。不锈钢发酵罐的实消（实罐灭菌）操作步骤繁琐但必须严谨，以确保彻底灭菌，避免染菌。今天，我们就来详细讲解不锈钢发酵罐的实消操作流程，帮助大家掌握关键步骤！

一、灭菌前的准备工作

1、设备清洗与管路吹洗

彻底清洗发酵罐及管路，吹除杂质，确保蒸汽系统畅通。

2、启动辅助设备

提前启动蒸汽发生器、空压机、循环冷冻机，为灭菌做好准备。

3、罐体操作

关闭所有阀门，尤其是罐底阀，防止误操作。旋紧接种口盖、补料口及罐盖螺丝，确保密封性。pH电极标定：根据发酵液酸碱性选择缓冲液（酸性用6.86和4.01，碱性用6.86和9.18），完成零点和斜率标定。DO电极标定：灭菌前标定零点（用饱和无水亚硫酸钠溶液），灭菌后接种前标定斜率（100%）。注入培养基至罐体60%~80%容量。检查公用系统连接，确保无松动。连接排气管道，启动控制器电源，设置温度和转速参数。

二、灭菌工作

当蒸汽压力达到0.4MPa时，开始灭菌，分为三步进行：

1、第一步：预加热

关闭所有阀门，打开蒸汽出口阀门，蒸汽进入总管。打开尾气出口阀门，排出冷空气。缓慢打开进夹套蒸汽阀门，观察温度变化，待温度升至50℃时，检测蒸汽到达位置。调节排冷凝水阀至“微调”状态，提高蒸汽利用率。开启搅拌，使培养基受热均匀。温度达90℃时，减小夹套进汽阀门开度，准备进入快速升温阶段。

2、第二步：快速升温

打开精过滤器排冷凝水阀，缓缓打开第二路蒸汽阀门，排尽冷凝水后调为“微调”。打开进罐空气阀旁的排冷凝水阀，排尽冷凝水后调为“微调”。温度达98℃时，打开进罐空气阀，蒸汽进罐。调节排气阀和进罐空气阀开度，加速升温。温度达100℃时，停止搅拌，保护机械密封。打开第三路蒸汽，蒸汽进入罐底阀阀腔，开放料阀排冷凝水。略微打开罐底阀，观察罐内培养基变化，调节进罐空气阀和尾气出口阀开度，防止“倒液”。温度达121℃或压力达0.1MPa时，旋松接种口盖，至4个小孔有蒸汽冒出即可。

3、第三步：保温阶段

关闭罐底阀，调节进罐空气阀和尾气出口阀开度，保持温度121℃、罐压0.1MPa。稳定后开始计时30分钟，按“先开后关”原则关闭各阀门。先关接种口盖，再关第三路蒸汽和第二路蒸汽阀门。过滤器压力降至0.05MPa时，关闭精过滤器排冷凝水阀。关第一路蒸汽，先关排夹套冷凝水阀门，再关进夹套蒸汽阀门。注意尾气出口阀开度，防止罐压下降过快或出现“倒吸”。

三、灭菌后的冷却工作

冷却工作分为通空气和通循环水两部分：

1、通空气

打开空压机出气口阀门和流量计阀门。打开过滤器空气阀门，维持过滤器压力表在0.12~0.15MPa。打开过滤器排冷凝水阀，用空气吹干过滤器。待无冷凝水后，打开进罐空气阀旁的排冷凝水阀，用空气吹滤芯，关闭过滤器排冷凝水阀。

2、通循环水

打开循环水总阀门和进夹套循环水阀门、夹套至加热器阀门。按下面板上注水开关，待循环水回总管口有水冒出后，松开注水开关。设置发酵所需温度，将控制方式改为“自动”。温度降至105℃时，打开进罐空气阀门，关闭排冷凝水阀。调节进罐空气阀门和尾气出口阀开度，维持罐内正压。启动搅拌，保证培养基降温均匀。温度降至发酵所需温度时，即可接种发酵。

四、注意事项

? 安全第一：操作蒸汽时戴手套，避免烫伤；接种口盖旋松时需双手操作，防止高压喷出。

? 防止倒液：确保过滤器压力>排气压力，避免培养基倒流。

? 灭菌彻底：保温阶段必须维持121℃、30min，否则可能导致染菌。

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